1. primer5引物设计酶切位点

引物设计有 3 条基本原则：

引物与模板的序列要紧密互补。

引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构。

再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。

引物设计

引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与目的基因一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与目的基因另一端的另一条DNA模板链互补。

在PCR（聚合酶链式反应）技术中，已知一段目的基因的核苷酸序列，根据这一序列合成引物，利用PCR扩增技术，目的基因DNA受热变性后解链为单链，引物与单链相应互补序列结合，然后在DNA聚合酶作用下进行延伸，如此重复循环，延伸后得到的产物同样可以和引物结合。

PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。如前述，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。

引物设计有 3 条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。具体实现这 3 条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度（primer length），产物长度（product length），序列 Tm 值 (melting temperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性(internal stability, 用 ∆G 值反映)，形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplexformation and hairpin）的能值，在错配位点（false priming site）的引发效率，引物及产物的GC 含量（composition），等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。

设计要求

做Real Time时,用于SYp Green I法时的一对引物与一般PCR的引物,在引物设计上所要求的参数是不同的。引物设计的要求：

避免重复碱基，尤其是G。

Tm=58-60度。

GC=30-80%。

3'端最后5个碱基内不能有多于2个的G或C。

正向引物与探针离得越近越好，但不能重叠。

PCR扩增产物长度： 引物的产物大小不要太大，一般在80-250bp之间都可；80～150 bp最为合适（可以延长至300 bp）。

引物的退火温

2. primer premier5酶切位点

你可以设计带有酶切位点的引物，对目的基因进行PCR，就可在目的基因上引入酶切位点。步骤：引物设计（借助软件）——合成引物（公司合成）——PCR。最重要的一个仪器就是PCR仪了，具体的加什么试剂，加多少，我想楼主应该是做分子生物学，这些应该挺清楚的了。楼主，引物一般是用软件设计，例如Primer.5，你根据你的目的基因两端的特点，设计合适的引物，然后在引物上再添加酶切位点 ，例如EcoRⅠ 是应用最广泛的限制性内切酶，酶切位点和切割位点如下： 5' G↓AATTC 3' 3' CTTAA↑G 5' ，你就可以在这两条引物上分别添加这几个脱氧核苷酸，这不就在引物中引入酶切位点了吗？经过PCR后引物和目的基因连在一起，酶切位点自然也连上去了。楼主，你可以根据需要，引入不同的限制性内切酶的酶切位点。

3. primer5酶切位点分析

DNA回收的主要目的是为了去除杂质，得到更纯的DNA目的片段，用来做后续的实验，（主要用来做连接）如果是除盐，换Buffer体系的话做DNA（PEG，乙醇）做沉淀就好了，不需要做DNA回收。

要回收的DNA说明是有用的。例如，通常经过酶切的DNA分子要进行凝胶电泳，将杂带和你要的条带区分看，并把你要的那部分回收，充分除盐，以进行后续的DNA连接等操作。

再如，经过PCR扩建的基因片段也是要进行凝胶电泳并回收的。因为PCR的产物除了你要的基因片段之外，还有模板、primer、错配片段等不需要的基因片段，进行凝胶电泳可以将它们进行初步分离，之后回收你的PCR产物才能进行后续的分子实验。

4. primer5设计荧光定量pcr引物

a引物长度一般在20bp左右，上下游引物碱基长度不要相差超过4个碱基。

b引物退火温度一般在58度，不同软件TM使用不同的算法，primer3，primer5，primer6，primerexpress等一般可以设置在55-58度，beacondesign可以设置在65左右。

cGC含量一般没什么特殊要求，40-60最好，如果不好设计，30-80也是可以的。

d产物长度在100-150,80-200也可以，不要在50bp左右，那样和引物二聚体不易区分，超过200bp可能会影响PCR扩增效率。

e软件给出的引物不能有发卡结构和超过3-4个碱基的匹配，特别是3`端不能有碱基匹配，那样更容易形成二聚体。

f引物设计好以后，在NCBI上做一个primer-blast，检测一下是否有非特异性扩增。

5. 设计引物在5端加酶切位点

设计好引物后，分别在上下游引物的5’端加上你所需要引入的酶切位点就可以了。如果PCR产物需要酶切，就需要加上保护碱基。不同酶切位点所需要的保护碱基是不一样的，一般参考NEB网站上的一个保护碱基表。一搜就有了。

如果不做PCR产物酶切而是直接连接T载体，就可以不加保护碱基，PCR结束后直接加A连T,然后按流程操作就可以了。

一般是需要转化-验证-测序，如果是构建表达载体的话还有酶切、连接、验证。