2023-12-18 12:39来源：m.sf1369.com作者：宇宇
一、目的 掌握 folin 一酚法测定蛋白质含量的原理方法，熟悉分光光度计的操作。 二、原理 folin 一酚法测定蛋白质含量的过程包括两步反应：第一步是在碱性条件下蛋白质与 cu 2 + 作用生成络合物，第二步是此络合物还原 folin 试剂（磷钼酸和磷钨酸试剂），生成深蓝色的化合物，且颜色深浅与蛋白质的含量成正比关系。该方法灵敏度高于双缩脲法 100 倍。硫酸铵、甘氨酸、还原剂如二硫苏糖醇（ dtt ）、巯基乙醇等会干扰反应。 三、仪器与试剂 1 .仪器 （ 1) 分光光度计 （ 2 ）水浴 （ 3 ）试管 （ 4 ）具塞试管 8 支 （ 5 ）小烧杯 2 支 （ 6 ）漏斗及架 （ 7 ）分析天平 （ 8 ）吸管： 0 . 5m1 x 1 ， 1m1x2 ， 5m1 x 1 （ 9 ）容量瓶： 100m1 x 2 ， loml x 1 （ 10 ）滤纸、玻棒等 （ 11) 研钵 （ 12 ）离心机、离心管 2 .试剂 （ 1 ） 0.5mol/ l naoh (2) 试剂甲 1) 称取 1og na2c03 , 2g naoh 和 0.25g 酒石酸钾钠，溶解后用蒸馏水定容至 500m1 。 2) 0. 5g 硫酸铜 (cus0 4 · 5h 2 o) 溶解后，用蒸馏水定容至 100m1 。 每次使用前将 a 液 50 份与 b 液 1 份混合，即为试剂甲。此混合液的有效期 只有 1 天，过期失效。 (3) 试剂乙：在 1.5l 容积的磨口回流器中加入 100g 钨酸钠 ( na 2 wo 4 .2h 2 0 ）， 25g 钼酸钠（ na 2 mo 4 .2h 2 0 ）及 700m1 蒸馏水，再加 50m1 85 ％磷酸， 100m1 浓盐酸充分混合，接上回流冷凝管，以小火回流 10h, 回流结束后，加入 150g 硫酸锂， 50ml 蒸馏水和数滴液体溴，开口继续沸腾 15min ，驱除过量的溴，冷却后溶液呈黄色（若仍呈绿色，须再重复滴加液体溴数滴，再继续沸腾 15min ）。然后稀释至 1l ，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时大约加水 1 倍，使最终浓度相当于 1 mol ／ l 盐酸。 3 .材料 绿豆芽或其他植物材料。 四、操作步骤 1 .标准曲线的绘制 (1) 配置标准牛血清白蛋白溶液：在分析天平上精确称取 0.025g 结晶牛血清白蛋白，倒至小烧杯内，加入小量蒸馏水溶解后转入 100m1 容量瓶中，烧杯内的残液用少量蒸馏水冲洗数次，冲洗液一并倒入容量瓶内，最后用蒸馏水定容至刻度，配制成标准蛋自质溶液，其中牛血清白蛋白的浓度为 250 ug/ ml 。 (2) 系列标准牛血清白蛋白溶液的配制：取具塞试管 6 支，按下表加入牛血清白蛋白标准溶液及蒸馏水。然后各管加入试剂甲 5ml ，混合后在室温下放置 10min ，再加 0.5ml 试剂乙，立即混合均匀（这一步速度要快，否则会使显色程度减弱）。 30min 后，以不含蛋白质的 1 号试管为对照，与其他 5 支试管内的溶液依次用分光光度计于 5oonm 波长下比色。记录各试管内溶液的吸光度。 试剂 1 2 3 4 5 6 250ug/mg 牛血清蛋白（ ml ） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 h 2 o (ml) 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 蛋白质含量（ ug ） 0 50 100 150 200 250 (3) 标准曲线的绘制：以吸光度为纵标，以牛血清自蛋白含量（ ug ）为横坐标，绘制标准曲线。 2 .样品测定 （ 1) 称取绿豆芽下胚轴 1g 于研钵中，加蒸馏水 2m1, 匀浆。转入离心管，并用 6m1 蒸馏水分次洗涤研钵，并入离心管。 4000r/min 离心 20min. 弃去沉淀，上清液转入容量瓶，定容至 10m1. (2) 取具塞试管 2 支，各加入上清液 l ml, 分别加入试剂甲 5m1, 混匀后放置 lomin ，然后加试剂乙 0.5 ml ，迅速混匀，室温下放置 30min ，于 500nm 波长下比色，记录吸光值。 五、结果处理 从标准曲线上查出测定液中蛋白质的含量 x （ ug ），然后计算样品中蛋白质的百分含量。 六、注意事项 folin 试剂（试剂乙）在碱性条件下不稳定，但此实验中反应在 ph 10 时发生，因此在 folin 试剂反应时应立即混匀，否则显色程度减弱。
可按以下步骤进行处理：
1. 分布检验：确定试验结果服从哪种分布。方法有简单的正态概率纸法、解析法、
相关系数法等。
2. 计算疲劳寿命的统计值：平均寿命和寿命的标准差。或者计算B10寿命等。
3. 将平均寿命、寿命的标准差或者B10寿命与产品验收标准相比照，给出产品疲劳寿命
是否达标的结论。
4. 要强调的一点是：只给出平均寿命的指标是远远不够的。平均寿命达标表明50%以上的零件达标，不要忘记还有50%的零件不达标。还必须给出寿命分散性指标: 方差。以上仅给出疲劳试验数据最简单的处理方法。
